非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型双重SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法的建立

为建立同时检测非洲猪瘟病毒(ASFV)和猪圆环病毒2型(PCV2)核酸的荧光PCR方法,试验根据GenBank中ASFV的p72基因和PCV2的ORF1基因序列,分别设计特异性引物,通过对加样体系和扩增程序的优化,建立了检测ASFV和PCV2的双重SYBR Green Ⅰ荧光PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行评价,最后对收集的临床样品进行检测.结果表明,最终确立的20 μL反应体系中各引物最佳添加量为:F1 0.7 μL、R1 1.0 μL、F20.8 μL和R2 1.5 μL;优化后的扩增反应程序为:95℃预变性3 min;94℃变性5 s,54℃退火20 s(此处收集荧光),40个循环.该方法具有很好的特异性,不与其他常见猪病原体发生交叉反应.检测ASFV和PCV2的灵敏度分别可达5.6 copies/μL和3.2 copies/μL,Tm值的批内和批间变异系数均不高于1.0％,对14份临床样品的检测结果与参比方法一致.本研究所建立ASFV和PCV的双重SYBR Green Ⅰ荧光PCR方法敏感性高,特异性好,可用于临床2种疾病的快速检测.