前纤维蛋白点突变对粗糙脉孢菌生长的影响及其生化机制研究

[目的]为进一步了解前纤维蛋白(profilin,PFN)在丝状真菌中的功能,本文以粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)为研究对象,进行了前纤维蛋白对其菌落生长和肌动蛋白(actin)聚合特性影响的探究.[方法]通过采用定点突变、同源重组、分生孢子过膜和PCR等技术,获得粗糙脉孢菌前纤维蛋白F78(F78A和F78D)和V113(V113E、V113R和V113W)的点突变体.利用平板生长法、竞争性生长管和显微镜观察检测表型变化,并结合多聚脯氨酸亲和层析纯化、荧光分光光度技术和高速共沉淀等技术分析点突变的前纤维蛋白对肌动蛋白聚合特性的影响.[结果]获得的粗糙脉孢菌前纤维蛋白点突变株F78A、F78D、V113E、V113R和V113W,与对照菌株ku70RIP相比,突变株生长均明显减慢(P＜0.05),其中PFN(F78D)和PFN(V113W)的突变体在生长的12-48 h,菌落直径分别仅为对照的20.0％-75.7％和12.7％-39.2％.竞争性生长管分析表明,PFN(F78D)和PFN(V113W)突变株菌丝生长速度受到显著抑制,分生孢子形成的节律并未发生明显改变.将纯化获得的前纤维蛋白野生型及点突变株F78D和V113W蛋白进行肌动蛋白的成核研究发现,前纤维蛋白能抑制肌动蛋白自发的成核过程,并表现为浓度依赖效应;而点突变蛋白F78D和V113W抑制肌动蛋白自发成核的作用减弱;进一步对肌动蛋白聚合特性的研究发现:野生型的前纤维蛋白在0-5μmol/L范围内可抑制肌动蛋白的聚合,且随浓度上升抑制作用进一步增强,致使上清中单体肌动蛋白含量最高可上升至82％左右;而5 μmol/L点突变蛋白F78D和V113W抑制肌动蛋白聚合的作用均明显减弱,分别使单体肌动蛋白的含量比对照下降12.0％(P＜0.01)和30.7％(P＜0.01).[结论]本研究证实前纤维蛋白在粗糙脉孢菌中起着重要的作用,其F78和V113是重要的活性位点,对于调节肌动蛋白的聚合解聚过程和粗糙脉孢菌的生长发育具有重要作用.