棉铃虫乙醇脱氢酶的表达规律

乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase,ADH)是一种在醇类代谢途径中起重要作用的脱氢还原酶.为了深入了解ADH对棉铃虫CYP6B6的调控,基于酵母单杂交的实验结果,采用RT-PCR的方法从六龄幼虫的中肠cDNA中扩增得到棉铃虫乙醇脱氢酶5(HaADH5),构建重组菌株BL21-pET32a-HaADH5,IPTG诱导表达后通过镍柱纯化获得目的蛋白,Western blot检测目的蛋白的表达和纯化结果,实时定量PCR检测棉铃虫不同发育阶段和组织中HaADH5的表达规律,最后检测2-十三烷酮处理下六龄幼虫中肠组织内HaADH5的变化规律.结果表明,克隆得到的HaADH5大小为1 002 bp,编码334个氨基酸,预测的蛋白质分子量和等电点分别是36.5kD和6.55.氨基酸序列分析表明HaADH5蛋白不含信号肽和跨膜结构域.HaADH5在大肠杆菌BL21中主要以可溶蛋白形式存在,Western blot结果显示融合蛋白His-HaADH5的大小与预期一致且纯度较高.HaADH5在棉铃虫的所有组织中都表达且中肠内表达量最高,在幼虫的所有龄期都表达且预蛹期的表达量最高.2-十三烷酮处理后HaADH5的表达量降低,且10 mg/g处理组中HaADH5和CYP6B6随着时间的延长表达规律相一致.本文将为后续利用HaADH5作为分子标记来研究棉铃虫蜕皮和变态发育过程奠定基础.