棉蚜P450 CYP6CY3的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备

[目的]克隆得到棉蚜(Aphis gossypii) P450 CYP6CY3,将其开放阅读框(ORF)在原核细胞中进行表达,纯化融合蛋白,多次免疫小鼠获得CYP6CY3多克隆抗体,为进一步分析CYP6CY3在棉蚜不同组织部位的分布及其在抗性中的作用打下基础.[方法]利用RT-PCR及3'-RACE技术克隆获得CYP6CY3的ORF,并对其进行生物信息学及系统进化分析.构建重组质粒pET32a-CYP6CY3,转化大肠杆菌transetta(DE3)进行原核表达,利用切胶回收法获得纯化的融合蛋白,继而用纯化得到的融合蛋白免疫昆明白小鼠制备鼠抗棉蚜CYP6CY3多克隆抗体;ELISA检测鼠抗CYP6CY3蛋白多克隆抗体的效价,并通过Western blot及免疫组化检测该抗体特异性.[结果]棉蚜CYP6CY30RF长1 266 bp,编码4 21个氨基酸,预测蛋白分子量为48.8 kD,理论等电点为8.99,不合有信号肽序列,属亲水性蛋白;氨基酸序列包括W×××R、AG× ×T、E× ×R、P× ×F×PE/DRT和F× ×G×××C×G 5个P450家族的特征基序.通过NCBI Blastx进行同源序列的比对分析,棉蚜CYP6CY3氨基酸序列与豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum) (XP_ 001948581.1)氨基酸一致性最高,达到81％,与麦双尾蚜(Diuraphis noxia) (XP_ 015379193.1)一致性为79％,与桃蚜(myzus persicae)(AHB52749.1)氨基酸序列一致性为76％,4种蚜虫的氨基酸序列都含有位于螺旋K中参与稳定核心结构的E× ×R完全保守序列及P450基因标志性的F× ×G×××C×G(358-367)血红素结合位点的共有序列.使用MEGA5软件构建系统进化树,显示棉蚜、豌豆长管蚜、麦双尾蚜及桃蚜聚为一类,亲缘关系较近.通过原核表达得到的CYP6CY3融合蛋白的相对分子量约为66 kD,基于纯化的CYP6CY3重组蛋白多次免疫昆明白小鼠制备多克隆抗体,ELISA检测获得的鼠抗CYP6CY3抗体效价达到1∶409 600.Western blot和免疫组化进一步证实,该抗体既能与异源表达的CYP6CY3蛋白特异性结合,也能与棉蚜组织中存在的天然CYP6CY3蛋白特异性结合,具有较好的免疫反应特异性.[结论]利用3'-RACE技术克隆获得CYP6CY3的开放阅读框,并用异源表达的蛋白免疫昆明白小鼠制备了高滴度、特异性强的鼠抗棉蚜CYP6CY3的多克隆抗体,可用于进一步研究CYP6CY3功能及其在棉蚜抗药性方面的作用.