布鲁杆菌Ⅳ型分泌系统蛋白VirB9免疫原性检测

目的 检测布鲁杆菌Ⅳ型分泌系统蛋白VirB9的免疫原性,寻找潜在的、新的布鲁杆菌亚单位疫苗靶标.方法 采用双酶切的方法,将布鲁埃希菌VirB9基因全长克隆至原核表达载体pET32a上,将克隆后载有VirB9基因的pET32a质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组VirB9蛋白在大肠埃希菌中的表达.利用重组VirB9蛋白所携带的His标签,通过Ni-NAT层析,纯化在大肠杆菌中重组表达的VirB9蛋白,再通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳和二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒对纯化的蛋白进行纯度及浓度检测.用布鲁杆菌疫苗株S19株免疫BAL B/c小鼠,并以磷酸盐缓冲液(PBS)为对照.在免疫4周后,鼠尾取血,血清虎红平板凝集试验、试管凝集试验检查小鼠血清抗体；酶联免疫吸附试验(ELISA)检测S19株免疫小鼠体内抗VirB9抗体滴度.在免疫后第35天,取小鼠脾脏,分离脾细胞,利用Elispot技术,检测VirB9蛋白体外再刺激后分泌细胞因子(干扰素-γ,IFN-γ)的脾细胞数,酶联斑点图像仪计数斑点,每个斑点代表1个抗原特异性T淋巴细胞,分析VirB9刺激机体产生细胞免疫反应的情况.结果 通过酶切克隆的方法成功地将VirB9全长基因741 bp克隆至pET32a载体上.SDS-PAGE显示,VirB9蛋白的相对分子质量约43×103,纯度超过97％；BCA法检测,蛋白浓度为1.6 g/L.免疫组小鼠血清虎红平板凝集试验阳性,试管凝集试验小鼠血清抗体滴度＞ 1∶800;对照组小鼠血清虎红平板凝集试验阴性,试管凝集试验小鼠血清抗体滴度阴性.免疫组检测到抗VirB9蛋白抗体,抗体滴度均＞1:3200,对照组小鼠体内未检测到抗VirB9蛋白抗体的存在.酶联斑点图像分析显示,用VirB9蛋白体外刺激,免疫组小鼠5×105个脾细胞中有147个细胞可以分泌IFN-γ,对照组仅有38个细胞.结论 在布鲁杆菌感染过程中,Ⅳ型分泌系统蛋白VirB9具有免疫原性,能够刺激小鼠产生体液免疫反应与细胞免疫反应.